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Von den Grundlagen der Laborarbeit über aktuelle Methoden und Verfahren bis zum Fortgeschrittenenwissen

Die Molekularbiologie hat sich in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt. Vor wenigen Jahren noch völlig unbekannte Technologien und Verfahren, wie die Modulare Klonierung, PCR-basierte Klonierungen oder das Gibson Assembly gelten heute als Standard.

Dies ist das bislang einzige Methodenbuch, das die neuen, inzwischen weit verbreiteten Verfahren, wie Gibson Assembly, Golden Gate, MoClo und Genom Editierung, beschreibt.

Diese und viele andere zukunftsweisenden Verfahren wurden aussagekräftig illustriert, zahlreiche Wissensboxen, Tipps und Protokolle machen den Titel zum perfekten Praxisbegleiter. Ideal für Bachelor- und Master-Studierende und für Berufspraktiker!

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Vorwort zur 1. Auflage 12

Vorwort zur 2. Auflage 13

1 Das Leben und seine Bestandteile

1.1 Der Aufbau von DNA und RNA 17

1.2 Der genetische Code 20

1.3 Die Gene 22

1.3.1 Die Genstruktur in Prokaryoten 22

1.3.2 Genstruktur in Eukaryoten 24

1.4 Proteine 26

1.5 Die Zelle 30

2 Grundlagen der Arbeit im Labor

2.1 Wasser 34

2.2 Messung des pH-Werts 35

2.3 Puffer 36

2.4 Waagen 36

2.5 Mikropipetten 38

2.6 Gefäße im Labor 40

2.7 Zentrifugen 41

2.8 Mischen und Konzentrieren 44

2.8.1 Konzentrieren 45

2.8.2 Pufferwechsel 45

2.9 Probenlagerung 46

2.10 Steriles Arbeiten 46

2.11 Geräte für den Aufschluss von Geweben 49

2.12 Pflege und Aufzucht von Escherichia coli 51

2.12.1 Nährmedien 52

2.12.2 Antibiotika 53

2.12.3 Lagerung von Bakterien 55

3 Aufreinigung von Nukleinsäuren

3.1 Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-Isolationen 59

3.1.1 Nukleasen 59

3.1.2 Scherkräfte 60

3.1.3 Chemische Verunreinigungen 60

3.1.4 EDTA und zweiwertige Ionen: das Yin und Yang der Molekularbiologie 61

3.2 Extraktion von Nukleinsäuren 62

3.3 Die weitere Aufreinigung der DNA 64

3.3.1 Phenolextraktion 64

3.3.2 Ethanolfällung 65

3.3.3 Isopropanolfällung 67

3.3.4 PEG-Fällung 68

3.3.5 Entfernen von Polysacchariden mit CTAB 68

3.3.6 Tropfendialyse 68

3.4 Silica Matrices 69

3.4.1 Von Nukleinsäuren und Silica Matrices 69

3.4.2 Übersicht über den Einsatz von Kits 70

3.5 Ausgewählte DNA Aufreinigungsverfahren 71

3.5.1 Die Plasmidpräparation aus E. coli 71

3.5.2 Die Isolation von DNA aus Pflanzen mit CTAB 72

3.5.3 Isolation von DNA aus Blut oder Zellkulturen 74

3.5.4 Isolation hochmolekularer DNA 75

3.6 Die Isolation von RNA 76

3.7 Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren 78

3.8 Quantifizierung von Nukleinsäuren 79

3.8.1 DNA-Bestimmung im Photometer 79

3.8.2 Konzentrationsbestimmung mittels optischer Dichte 81

4 Polymerase- Kettenreaktion

4.1 Prinzip der Polymerase- Kettenreaktion 85

4.2 Die Komponenten der PCR 86

4.2.1 Die Ausgangs-DNA 86

4.2.2 Thermostabile DNA-Polymerasen 86

4.2.3 Puffer, Magnesium und dNTPs 89

4.2.4 Primer 91

4.3 Geräte für die PCR 93

4.4 Die Standard-PCR 94

4.5 Ausgewählte PCR-Methoden 94

4.5.1 Two-Step PCR 94

4.5.2 Gradienten-PCR und Touch-Down PCR 96

4.5.3 Nested PCR 97

4.5.4 Multiplex PCR 97

4.5.5 Einführen von Restriktionsschnittstellen 98

4.5.6 Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) 99

4.5.7 Kolonie-PCR 102

4.5.8 Quantitative PCR 103

4.6 Anwendungen der PCR 105

4.7 Optimierung der PCR-Reaktion 105

5 Klonieren für Einsteiger

5.1 Restriktionsenzyme 109

5.1.1 Restriktionsenzyme des Typs II 110

5.1.2 Restriktionsenzyme im Labor 113

5.1.3 Methylasen und Typ IIM-Enzyme 115

5.1.4 Typ IIS-Enzyme 116

5.2 Ligation 116

5.3 (De)Phosphorylierung von DN 118

5.3.1 Dephosphorylierung 118

5.3.2 Phosphorylierung 119

5.4 Enzyme für spezielle Aufgaben 121

5.5 Die Transformation von E. coli 121

5.6 Der Weg zum klonierten Gen 123

5.7 Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor 123

5.7.1 Die Klonierung über eine Restriktionsstelle 124

5.7.2 TA-Klonierung und TOPO-Cloning 125

5.7.3 Klonierung in ein Letal-Plasmid 126

5.7.4 Zyklische Blunt End Klonierung 126

5.8 Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor 127

5.9 Wenn es mal nicht klappt ... 129

6 Vektoren

6.1 Plasmide 132

6.2 Klonierungsplasmide 135

6.2.1 Blau-Weiß-Screening 135

6.2.2 Letalvektoren 138

6.3 Expressionsplasmide 139

6.3.1 Promotoren für Expressionsvektoren 140

6.3.2 Weitere regulative Sequenzen 141

6.3.3 Expression in das Periplasma 141

6.3.4 Einschlusskörperchen [Inclusion Bodies] 141

6.3.5 Tag-Sequenzen 142

6.4 Reportergene 142

6.5 Phagen 146

6.6 Phagemide 147

6.7 Shuttle-Vektoren 147

6.8 Künstliche Chrom

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